KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DALAM BIDANG FARMASI

EFFENDY DE LUX PUTRA Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara I. PENDAHULUAN 1.1. Sejarah Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih. Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas. 1.2. Kelebihan KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak © 2004 Digitized by USU digital library 1 cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain: • mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran • mudah melaksanakannya • kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi • dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis • Resolusi yang baik • dapat digunakan bermacam-macam detektor • Kolom dapat digunakan kembali • mudah melakukan "sample recovery" II. JENIS-JENIS KROMA TOGRAFI 2.1. Kromatografi padatan cair (LSC) Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel- partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer. 2.2. Kromatografi partisi Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC) Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam. 2.3. Kromatografi penukar ion (IEC) Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion. 2.4. Kromatografi eksklusi Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan © 2004 Digitized by USU digital library 2 ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil. 2.5. Kromatografi pasangan ion (IPC) Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama. Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa basa kuat). IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel. Sebagai contoh, untuk pemisahan suatu kelompok asam-asam karboksilat menggunakan suatu fase gerak yang dibufer pada pH 7,0 supaya semua senyawa- senyawa sampel berada dalam bentuk RCOO (dilambangkan dengan R). Ion tanding dalam hal ini bisa berupa tetrabutyl ammonium ion, BU4N+ (atau TBA+).Dalam hal yang paling sederhana dari IPC, dapat dianggap bahwa sampel dan ion tanding dapat lama hanya dalam fase gerak air, dan pasangan ion yang dibentuk dari ion-ion ini dapat larut hanya dalam fase diam organik. Dalam hal ini dapat ditulis persamaan untuk distribusi sampel R- diantara dua fase : pasangan Ion Tulisan aq dan org menunjukkan fase air dan rase organik. Konstanta ekstraksi E selanjutnya ditetapkan dengan persamaan : Dimana E adalah konstant untuk suatu sistem IPC khusus, tetapi bervariasi dengan pH fase gerak dan kekuatan ion, konsentrasi dan jenis kosolven organik didalam fase gerak (misal metanol atau asetonitril) dan suhu. Kapasitas faktor k3,berhubungan dengan E sebagai berikut : © 2004 Digitized by USU digital library 3 Maka harga k3 untuk semua senyawa-senyawa sampel (untuk unit bermuatan negatif) diduga sebanding dengan konsentrasi ion tanding TBA+. Catatan bahwa koefisien distripbusi K berhubungan dengan E sehingga. Variasi dari (TBA+)aq memberikan suatu cara untuk mengontrol kekuatan solven dalam selektifitas. Dalam sistem fase balik, kekuatan solven dengan mudah dapat divariasi dengan mengubah ion tanding atau konsentrasinya. Untuk sistem fase balik pemisahan samapel anion atau sampel kation dapat dirumuskan dengan : Disini konsentrasi (C+) dan (C-), berturut-turut menunjukkan konsentrasi ion tanding kation dan konsentrasi ion tanding anion, dan E adalah konstan walaupun kondisi- kondisi lainnya diubah. Maka bertambahnya konsentrasi dari ion tanding dalam fase gerak menyebabkan bertambahnya k3 untuk IPC fase batik ( dan berkurang pada JPC fase normal). Persamaan (6) dan (7) untuk ion-ion sampel terionisasi tunggal. Untuk ion-ion sampel bivalen atau trivalen, k’ berubah berturut-turut menjadi (C+)2 atau (C+)3. Dalam IPC fase normal, k' dapat divariasi dengan mengubah konsentrasi ion tanding dalam fase diam. Namun, hal ini kurang tepat karena berarti harus mengubah fase diam (mengisi kembali kolom = reloading the column). Dalam operasional fase normal ataupun fase balik IPC, k' dapat juga divariasi dengan mengubah jenis ion tanding (misalnya mengganti pentan sulfonat dengan heptan sulfonat). Penambahan satu gugus CH2 kepada molekul ion tanding menghasilkan suatu faktor sampai 2,5 kali (efek lebih besar pada ion tanding dengan konsentrasi rendah), molekul-molekul ion tanding yang lebih besar memberikan harga k' lebih kecil pada IPC fase normal. Kekuataan solven baik dalam fase normal ataupun fase balik IPC dapat juga divariasi dengan merubah polaritas fase gerak. Untuk sistem fase balik IPC tanpa penambahan fase diam organik, campuran air dengan salah satunya metanol atau asetonitril biasanya digunakan sebagai fase gerak. Bila persentase air dikurangi, maka pelarut menjadi lebih kuat dan harga k' sampel berkurang. Selain dari pada menaikkan konsentrasi ion tanding, menaikkan kekuatan ionik didalam fase air biasanya mengurangi pembentukan pasangan-pasangan ion, sebagai suatu hasil kompetisi dari ion-ion sekunder dalam membentuk pasangan- © 2004 Digitized by USU digital library 4 pasangan ion dengan ion tanding. Maka suatu kenaikan/pertambahan kekuatan ion akan menurunkan harga k' pada IPC fase balik dan akan meninggikan harga k' pada rase normal IPC. Satu studi membuktikan bahwa 2 sampai 3 kali lipat perubahan k' untuk setiap menggandakan kekuatan ion. Ion-ion sekunder yang muatannya sama dengan muatan ion sampel (misal : kationik atau anionik) mempunyai efek yang paling besar pada harga k' sampel. Dalam suatu studi meliputi pemisahan anion- anion sampel dengan IPC, efek dari ion-ion sekunder terhadap k' bertambah dalam urutan NO3